荷兰皇家艺术与科学院Hans Clevers团队筹商报说念了从妊娠8-17周（8-17GW）胎儿胰腺样品中繁衍的18个东说念主胎儿胰腺类器官（hfPO）系，其中4个细胞系繁衍自15-16个GW样品，在优化的培养条目下，产生腺泡、导管和内分泌谱系细胞，抓续扩增特等2年。单细胞RNA测序马虎胎儿胰腺和hfPO中漠视的LGR5+细胞，行为发育档次的基础。这些LGR5+细胞与成东说念主胃肠说念干细胞分享多个符号。来自单个LGR 5+类器官细胞的类器官在体外重现了这种三能性。

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著作先容

伸开剩余90% 题目：Long-term in vitro expansion of a human fetal pancreas stem cell that generates all three pancreatic cell lineages 杂志：Cell 影响因子：45.5 发表时辰：2024年12月

#1

筹商布景

Background

胰腺具有外分泌和内分泌两种功能，其中外分泌胰腺的腺泡细胞端庄分泌消化酶。尽管小鼠体内模子为胰腺发育提供了潜入视力，但东说念主类胰腺生物学筹商受限于东说念主-小鼠各别，主要依赖形态学轨范。近期，转录组筹商和东说念主类多颖慧细胞（hPSC）分化有设想为领路胰腺细胞分化提供了新视角，尤其是B细胞的产生。类器官技能的发展，极端是从iPSC或组织驻留干细胞（TSC）滋长的类器官，为模拟所有这个词胰腺提供了新模子，尽管它们主要皆集于产生胰岛素的B细胞。此前的筹商尝试从成年小鼠和东说念主类原发性胰腺TSC中建立类器官，但这些模子在体外倾向于导管谱系，穷乏腺泡和内分泌细胞。本筹商旨在从自然指定的胎儿胰腺TSC产生一个体外模子系统，以反馈上皮胰腺的复杂性，包括腺泡和内分泌细胞，为潜入领路胰腺发育和功能提供新的视角。

#2

筹商轨范

Methods

率先，从高出妊娠周（GW）8-17的20个寂然组织样品建立18个hfPO系的小生物库；

然后，通过mRNA-seq，转录组谱和各别基因抒发分析评估出芽和囊性hfPO之间的各别；

接下来，促进进一步熟练为随机产生消化酶的腺泡细胞；

临了考证hfPO随机向内分泌谱系分化。

#3

效果

Results麻豆传媒 黑丝

1、hfPO的恒久培养

对来自妊娠早期和妊娠中期的东说念主胎儿胰腺组织进行贬责并包埋在基底膜索取物（BME）基质中。3天后，在大多量培养基条目下出现小的囊性结构。10-14天后，仅在一种培养基（东说念主胎儿胰腺类器官（hfPO）培养基）中不雅察到深色的、出芽的葡萄样结构的出现。从高出妊娠周（GW）8-17的20个寂然组织样品建立18个hfPO系的小生物库。出芽的类器官仅出咫尺起首于14-16 GW样品的培养物中。“最老的"出芽系已畅达培养3年。仅在出芽的类器官中不雅察到漠视的嗜铬粒卵白-A（CHGA）阳性细胞（图1）。

图1.hfPO的建立

2、出芽的类器官抒发腺泡祖细胞记号物

手动分离来自相通系（hfPO 1、hfPO 2、hfPO 5）并在相通（hfPO扩增）培养基中培养的出芽和囊性hfPO，以及来自纯囊性系（hfPO 7、hfPO 8）的hfPO，并通过批量mRNA测序（mRNA-seq）进行分析。转录组谱标明，囊性和出芽hfPO永诀成簇。各别基因抒发分析炫耀，与囊性hfPO比较，腺泡记号物（羧肽酶A1[CPA 1]、RBPJL和PTF 1A）的抒发在出芽hfPO中更权贵，而导管记号物（角卵白7[KRT 7]、粘卵白1[MUC 1]和CEACAM 6）的抒发更低。还不雅察到内分泌记号物（NEUR 0 G 3、CHGA和CHGB）在出芽的hfPO中的抒发。此外，来安靖原始haPO培养基中培养的15至16个GW样品的hfPO不抒发腺泡或内分泌祖细胞基因。因此，hfPO培养基支柱分化为导管，而hfPO培养基允许所有三种胰腺细胞谱系的记号物的抒发，但在15-16个GW繁衍的类器官系中是独到的（图2）。

图2.出芽型hfPO与囊性hfPO不同

3、hfPO产生腺泡谱系的细胞

筹商东说念主员应用CRISPaint用荧光卵白tdTomato在C结尾符号腺泡基因CPA 1和PTF 1A。这也允许随后分离和分析抒发这些腺泡基因的细胞。在hfPO透露于滋长因子消耗的分化培养基（hfPO-AC）培养基7天后，使用荧皎皎微镜和荧光激活细胞分选（FACS）分析不雅察到基因抒发水平以及CPA 1+和PTF 1A+细胞数量的增多。这通过批量mRNA-seq进一步证实，其揭示了与腺泡细胞筹商的基因的上调以及消化酶的抒发（举例，CTRB/C、CEL和CEL 2A/3A）。筹商东说念主员通过透射电子显微镜（TEM）细则hfPO的分化是否导致这种颗粒的酿成。这揭示了行为熟练的进一步记号的分泌囊泡的存在。此外，使用全计数免疫荧光可视化CPA 1+和PTF 1A+细胞并证明卵白质抒发。筹商东说念主员还不雅察到消化酶胰卵白酶、RNA酶、脂肪酶、胰凝乳卵白酶和胰凝乳卵白酶样弹性卵白酶3A（CELA 3A）在卵白质水平的抒发增多以及抒发消化酶的细胞数量增多（CTRC）。通过ELISA和酶活性测定来评估胰卵白酶和脂肪酶的酶分泌。效果炫耀，诚然脂肪酶在扩增（hfPO培养基）和分化（hfPO-AC）培养基下都能分泌，但酶活性在两种条目下莫得权贵变化（图3）。

图3.hfPOs向腺泡谱系的分化

4、hfPO产生内分泌谱系的细胞

为了随机在分化后马虎和分离内分泌细胞，筹商东说念主员生成了内分泌解说基因hfPO系。克隆CHGA-hfPO解说类器官的聘请和扩增之后，在扩增培养基中不雅察到漠视的dTomato+细胞。在hfPO-EC培养基中7-10天后，该数量增多5-10倍。通过mRNA批量测序，在扩增与分化培养基中培养的hfPO永诀成簇。况且，CHGA的抒发增多以及胰腺激素GCG、INS、滋长抑素（SST）、GHRL和PPY的mRNA的出现。此外，TEM证实存在内分泌细胞特征性的囊泡。免疫荧光炫耀多激素细胞和单激素细胞的存在。内分泌谱系主转录因子NEUROG 360的抒发进一步支柱了早期内分泌细胞的抓续腾达。hfPO产生内分泌细胞的效用在培养物中抓续存在，因为RTqPCR炫耀hfPO在体外扩增2年后仍然不错产生INS产生细胞。临了，c-肽的ELISA炫耀hfPO随机在分化后产生和分泌c-肽。总之，这支柱hfPO随机产生更多分化的内分泌细胞（图4）。

图4.hfPO可向内分泌谱系分化

5、hfPO细胞详细了原代东说念主胎儿胰腺组织的重要方面

在筹商中，筹商东说念主员将hfPO-和hfPO-EC培养基中滋长的hfPO的转录组数据与相似发育阶段的东说念主类胎儿胰腺组织数据集进行了对比分析。进程质料圆寂，三个数据网络并成一个包含11755个细胞的数据集，hfPO细胞占总细胞数的20%。分析效果炫耀，hfPO与胎儿组织细胞之间存在高度相通，极端是在14和16周的妊娠时间。四个主要的细胞簇被识别出来，其中三个对应于胰腺的主要细胞谱系，第四个抒发干细胞记号物如SOX9和PROM1。hfPO细胞在干细胞簇中的孝敬较为权贵。鼠胰腺多能祖细胞的符号基因在hfPO细胞中获得抒发，与东说念主类胎儿胰腺的干/祖细胞相似。此外，转录因子GATA 4/6的抒发模式与预期一致，GATA4在腺泡区室抒发增多，而GATA6定位于导管和内分泌区室（图5）。

免疫组织化学染色炫耀，hfPO与胎儿和成东说念主胰腺组织在结构和符号基因抒发上存在各别。hfPO产生的腺泡细胞与孕早期和孕中期胎儿胰腺组织在基因抒发和水平上相当相似，而妊娠中期后期的胎儿组织更接近成东说念主组织。hfPO还能产生多种消化酶，其导管细胞与妊娠早期组织相似，并能产生MUC1。hfPO繁衍的B细胞也能产生胰岛素（INS），尽管成东说念主组织中INS的抒发水平更高。总体而言，hfPO在转录组谱和消化酶、粘液及激素产生方面与胎儿景况相似，标明其随机表型复制胎儿胰腺组织的特征（图6）。

图5.hfPOs在单细胞转录组水平上转录东说念主胎儿组织

图6.hfPOs详细了东说念主胎儿胰腺组织

6、LGR 5符号东说念主类三颖慧细胞

筹商东说念主员通过单细胞克隆技能莳植出类器官，并将其在特定培养基中扩增10天，以探究不同的胰腺细胞运说念。进程质料圆寂的scRNA-seq数据分析炫耀，这些类器官细胞不错分为五个主要的细胞簇，永诀代表祖细胞、腺泡祖细胞、腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞。极端是，抒发高水平的上皮干细胞记号物LGR5和TROY的细胞位于祖细胞簇的顶部。通过原位杂交妥协说基因技能，筹商东说念主员证实了LGR5+和TROY+细胞的存在，并评估了它们的类器官酿成智商和干细胞脾气。LGR5+细胞炫耀出更高的类器官酿成智商，标明它们具有干细胞脾气。进一步的本质炫耀，不同的培养基不错促进类器官向内分泌/腺泡或腺泡和导管细胞分化。移植本质中，这些类器官在免疫舛错小鼠中滋长，并施展出包含所有三种胰腺细胞谱系的东说念主类细胞。这些效果证实了单个LGR5+干细胞随机产生包含所有三种胰腺细胞谱系的类器官，为胰腺发育和疾病筹商提供了要紧的体外模子（图7）。

图7.LGR5符号三能东说念主胰腺祖细胞

小结

这项筹商告捷从15至16周的东说念主类胎儿胰腺中，建立了一个融会的类器官系。这些类器官随机从单个LGR5+多能祖细胞发展而来，并保抓分化为腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞的智商。这些胰腺祖细胞的恒久体外扩增后劲以及易于遗传修饰的特色，为筹商东说念主类胰腺的发育、生理和疾病提供了新的本质平台。此外，这一胰腺类器官平台有望股东再生医学的发展，通过细胞诊治或特定滋长因子的靶向诊治来建设胰腺功能扼制。

不同地区对东说念主类胎儿组织本质的法律和伦理司法存在各别。LGR5+细胞被合计是东说念主类的多能胰腺祖细胞，但它们与其他祖细胞群体之间确切切筹商以及这些群体的可塑性仍需进一步筹商。纠正熟练的培养有设想关于生成与成东说念主组织相匹配的外分泌/腺泡和内分泌细胞至关要紧。

参考文件

Andersson-Rolf A， Groot K， Korving J， Begthel H， Hanegraaf MAJ， VanInsberghe M， Salmén F， van den Brink S， Lopez-Iglesias C， Peters PJ， Krueger D， Beumer J， Geurts MH， Alemany A， Gehart H， Carlotti F， de Koning EJP， Chuva de Sousa Lopes SM， van Oudenaarden A， van Es JH， Clevers H. Long-term in vitro expansion of a human fetal pancreas stem cell that generates all three pancreatic cell lineages. Cell. 2024 Dec 2:S0092-8674(24)01254-6. doi: 10.1016/j.cell.2024.10.044. Epub ahead of print. PMID: 39626658.

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发布于：江苏省